Родился 13 ноября 1827 года в семье протоиерея Покровского собора в городе Шуе, Владимирской губернии. Окончил Шуйское духовное училище (1842) и Владимирскую духовную семинарию (1848). В числе лучших четырёх выпускников был отправлен в Московскую духовную академию, которую окончил в 1852 году. Выпускное сочинение - «О заслугах духовенства в отношении к верховной власти в России».

В октябре 1852 года назначен преподавателем в Вифанскую семинарию; с 1853 года одновременно был помощником инспектора семинарии. В 1854 году утвержден в степени магистра (тема диссертации: «Об отношениях духовенства русского к князьям с XI в. до половины XV в.»).

В 1855 году переведен в Московскую духовную академию, где с ноября 1855 года в звании бакалавра, а с февраля 1859 года в звании экстраординарного профессора преподавал библейскую герменевтику и учение о вероисповеданиях, ересях и расколах. С ноября 1857 года исполнял обязанности помощника инспектора, с сентября 1860 — помощника библиотекаря, а с ноября 1862 года стал библиотекарем Московской духовной академии, оставаясь в этой должности до мая 1864 года, когда был определён секретарём Комитета для цензуры духовных книг.

С 1870 года Субботин возглавил новую кафедру - истории и обличения русского раскола. В этом же году он был избран членом совета Московской духовной академии.

К 1874 году он завершил большой труд «Происхождение, так называемой, Австрийской или Белокриницкой иерархии», за который был удостоен степени доктора богословия. В этом же году он утверждён в звании ординарного профессора Московской духовной академии и избран помощником ректора по церковно-историческому отделению.

Николай Субботин был учредителем Братства святого Петра Митрополита и редактором-издателем миссионерского журнала «Братское слово», одним из редакторов академического журнала «Прибавления к Творениям Святых Отцов». Крупную его заслугу составляет издание большого числа первостепенных по своей важности источников по истории раскола и православной полемики против него.

Николай Иванович дружил и состоял в регулярной переписке с обер-прокурором Святейшего Синода К. П. Победоносцевым.

В 1894 году Субботин оставил преподавание в МДА и посвятил себя литературной работе. После закрытия журнала «Братское Слово», он стал публиковать свои статьи в газетах и журналах: «Московские ведомости», «Русский вестник», «Душеполезное чтение», «Вера и Церковь», «Православный путеводитель».

Скончался Николай Иванович на своей даче в Томилине и погребен 2 июня 1905 года в московском Никольском единоверческом монастыре, у северной стены алтаря Никольского храма, рядом с могилой своего друга и соработника — архимандрита Павла (Леднева).